已稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標板孔前都應預先在37℃中平衡至少30分鐘。試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻。每次檢測都應該做標準曲線。用戶須估計樣品待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數。

1.    確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目，并增加1孔作為TMB空白顯色孔?？倲?/span>=樣品數+9；做雙份檢測時×2。其余重包裝好放如冰箱中。

2.    將1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于人血清、血漿、體液、組織勻漿或細胞培養上清，直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣品100μι。

3. 酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。

4. 反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。不洗。

5. 將準備好的生物素抗人IL-2抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。（TMB空白顯色孔除外）。37℃反應60分鐘。

6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。

7. 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白顯色孔除外）。37℃反應30分鐘。

8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。

9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液，37℃避光反應8-12分鐘（注意：顯色時間供參考，因用戶實驗室條件差異，*顯色時間會有所不同。此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯）。

10. 按每孔0.1ml依次加入TMB終止液，此時藍色立轉黃色。

11. 用酶標儀在450nm測定O.D.值。顯色的程度通過ELISA酶標檢測儀測定光密度（OD：optical density）記錄。通過細胞因子的標準蛋白做已知濃度系列稀釋，測出OD值后繪制出標準曲線，根據標準曲線可推算出標本中細胞因子的含量，一般使用計算機軟件可以很快得到結果

有兩種設定空白對照的方案：

（1）將TMB空白顯色孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。

（2）將零孔設為對照。得到的數據可以直接在坐標紙上畫出曲線。

12. 根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。