ELISA不同方法介紹

我們知道ELISA方法也包含不同的方法和原理，主要有：雙抗夾心法ELISA、雙位點(diǎn)一步法ELISA、間接法ELISA、雙抗原夾心法ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制法ELISA、IgM抗體捕獲法ELISA、應(yīng)用親和素和生物素ELISA；下面我們就這幾種不同ELISA方法，逐一介紹：

一、雙抗夾心法

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，但僅適用于2價(jià)或2價(jià)以上抗原的檢測(cè)，而不適用于小分子抗原或半抗原物質(zhì)的測(cè)定。其測(cè)定原理是將特異性抗體包被于固相載體上，形成固相抗體；加入含待測(cè)抗原的樣品，使之與固相抗體結(jié)合；再加入酶標(biāo)記的另一特異性抗體，使酶標(biāo)抗體與固相免疫復(fù)合物中的抗原結(jié)合；zui后加入底物顯色。溶液顏色的深淺與標(biāo)本中待測(cè)抗原的量成正比。

二、雙位點(diǎn)一步法

    雙位點(diǎn)一步法是在雙抗體夾心法的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)的，應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，在測(cè)定時(shí)可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，而且由于使用了高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高；缺點(diǎn)是當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高，大大超過(guò)了固相抗體的結(jié)合能力時(shí)，可能出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)（hook effect），即過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，測(cè)得結(jié)果將低于實(shí)際含量，嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性。

三、 間接法  

    間接法主要用于檢測(cè)抗體，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的待測(cè)抗體。首先用特異性抗原包被固相載體，加入含待測(cè)抗體的樣品，使之與固相抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的第2抗體，使之與待測(cè)抗體結(jié)合；反應(yīng)后再加入底物顯色，顏色的深淺與標(biāo)本中待測(cè)抗體的量成正比。此方法的特點(diǎn)是只需一種酶標(biāo)記的第2抗體就可以檢測(cè)多種抗體，因而在臨床中廣泛用于檢測(cè)各種感染性疾病的抗體；缺點(diǎn)是易受到標(biāo)本中多種物質(zhì)的干擾而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。

四、 雙抗原夾心法  

    雙抗原夾心法與間接法的不同是用酶標(biāo)記的特異性抗原代替酶標(biāo)記的第2抗體，可以減少假陽(yáng)性反應(yīng)。

五、競(jìng)爭(zhēng)抑制法

    該法可用于檢測(cè)抗原或抗體，顯色的深淺與標(biāo)本中待測(cè)抗原或抗體量成反比。以測(cè)定抗原為例，待測(cè)樣品中的抗原與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，待測(cè)抗原含量越多，能與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原就越少，則顯色越淺。

六、IgM抗體捕獲法

    血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和非特異性IgM，以及特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM的測(cè)定。捕獲法則較好地解決了上述問(wèn)題，其原理是先用抗人IgM（／／鏈）抗體包被固相載體，使血清中所有IgM（包括特異性與非特異性IgM）均固定在固相上，經(jīng)洗滌去除IgG后，再測(cè)定特異性IgM。此方法目前主要用于檢測(cè)各類早期感染的特異性抗體IgM。

七、應(yīng)用親和素和生物素方法

    親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取，分子量為60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子緊密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244．31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素-羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide ester，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位點(diǎn)，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELISA耦聯(lián)起來(lái)，就可大大提高其靈敏度。

    親和素生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在固相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過(guò)親和素生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且可使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)記抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素與酶的結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。